Nicolas Steno được sinh ra trong một gia đình theo giáo hội Luther và là con trai của một thợ kim hoàn. Năm 19 tuổi, Steno vào Đại học Copenhagen để theo học ngành y.[4] Sau khi tốt nghiệp và đi nhiều nước Châu Âu, năm 1666 ông định cư ở Ý. Ông làm giáo sư giải phẫu học tại Đại học Padua và sau đó ở Firenze với tư cách là bác sĩ tại gia của Đại công tước Tuscany Ferdinando II.[3][5]

Steno chuyển sang đạo Công giáo vào năm 1667. Sau khi cải đạo, sự quan tâm của ông đối với khoa học tự nhiên đã suy giảm để nhường chỗ cho sự quan tâm của ông đối với thần học.[6] Ông được thụ phong linh mục vào dịp Lễ Phục Sinh năm 1675. Ông được Giáo hoàng Innôcentê XI bổ nhiệm làm Đại diện Tông tòa của các xứ truyền giáo Bắc Âu và Giám mục chính thức của Titopolis. Steno đã đóng một vai trò tích cực trong cuộc phản cải cách ở miền Bắc nước Đức.[5]